Adapter le Prime Editing aux mutations des histones chez les mammifères
Les histones canoniques H3 chez la souris sont codées par neuf gènes H3.1 et trois gènes H3.2, exprimés de manière dépendante de la réplication. La variante non canonique H3.3 est codée par deux gènes (H3f3a et H3f3b) et est exprimée tout au long du cycle cellulaire, étant principalement incorporée aux régions transcriptionnellement actives et hétérochromatiques, y compris les télomères et les péricentromères.
Pour établir le Prime Editing pour les mutations des histones, nous avons conçu un epegRNA optimisé ciblant les douze gènes H3 canoniques de souris afin d’introduire une mutation de lysine en arginine (K-to-R) au codon 23 (K23R) ainsi qu’une mutation silencieuse perturbant le PAM. Le plasmide exprimant l’epegRNA a été transfecté de manière transitoire dans des cellules souches embryonnaires (ESC) qui expriment de manière constitutive l’éditeur PEmax (système PE2). Nous avons également testé le PE3b, qui intègre un RNA de coupure, PE4, qui inhibe la réparation des mésappariements par l’expression d’un mutant dominant du MLH1 (MLH1dn), et PE5b, qui combine les deux stratégies. Les résultats d’édition dans les pools cellulaires résultants ont été évalués par PCR sur les 18 allèles H3.1, suivie d’un séquencement de nouvelle génération (NGS). PE4 et PE5b, qui inhibent tous deux la réparation des mésappariements, ont donné les meilleures efficacités d’édition et les plus faibles fréquences d’indels. Bien que PE4 et PE5b aient montré des performances similaires, nous avons choisi PE5b pour les expériences ultérieures en raison d’améliorations modérées en termes d’efficacité et de précision par rapport à PE4.
Les mutations H3K14R et H3K18R réduisent la viabilité cellulaire
Nous avons ensuite appliqué la stratégie de Prime Editing optimisée à deux autres lysines canoniques H3. H3K14 et H3K18, résidus hautement acétylés, sont principalement modifiés par KAT7 (HBO1) et KAT3A/KAT3B (CBP/p300), respectivement. Nous avons conçu un seul epegRNA pour chaque site.
Notamment, l’incorporation des mutations souhaitées à ces deux résidus était marquée par une efficacité inférieure à celle observée avec H3K23, sans obtenir de clones entièrement mutés. Ces données suggèrent des contraintes biologiques limitant le nombre d’allèles H3K14R et H3K18R tolérés par les ESC.
Le Prime Editing permet des mutations d’histones réversibles et combinatoires
Nous avons ensuite testé si les mutations introduites dans les histones pouvaient être réverties. Un epegRNA/nickRNA a été conçu pour restaurer la lysine au codon 23 chez les ESC H3K23R entièrement mutés. La transfection transitoire a permis une édition efficace dans les populations cellulaires. Le clonage par cellule unique a donné lieu à des lignées hautement réversées, démontrant que le Prime Editing permet une mutagenèse réversible des histones.
L’édition Prime dévoile une compensation des variants d’histone
Bien que H3.3 ne soit pas nécessaire à la viabilité des ESC, il pourrait compenser les mutations des H3.1/H3.2. Nous avons testé si H3.3 pouvait être efficacement muté en utilisant notre système avec des paires epegRNA/nickRNA distinctes pour chaque locus.
Les produits génomiques résultants de la mutagénèse des histones par Prime Editing
Nous avons évalué si cette approche induit des altérations génomiques à grande échelle au sein des clusters d’histones. Des séquençages génomiques peu profonds de clones partiellement H3K18R et totalement mutés H3K23R ont identifié des lésions occasionnelles.
Un écran d’édition Prime explore les contributions des lysines H3 à la viabilité
Nous avons cherché à muter systématiquement chaque résidu lysine au sein des histones H3 pour évaluer leur contribution à la viabilité cellulaire. Un epegRNA unique était suffisant pour onze résidus lysines.
Points à retenir
- Le système d’édition Prime offre des possibilités de mutations réversibles chez les histones.
- Les mutations H3K14R et H3K18R montrent des effets négatifs sur la viabilité cellulaire.
- L’évaluation de l’impact des mutations sur la dynamique cellulaire pourrait ouvrir de nouvelles pistes de recherche.
- Le Prime Editing pourra potentiellement se développer dans des applications cliniques pour cibler des mutations spécifiques.
En tant que journaliste passionné par les avancées scientifiques, je suis constamment fasciné par le potentiel de l’édition génétique. Les travaux sur les histones démontrent à quel point la précision de ces techniques peut transformer notre compréhension des mécanismes cellulaires. Toutefois, il est crucial de rester vigilant face aux implications éthiques et aux conséquences à long terme de ces recherches. Le dialogue autour de ces innovations doit être ouvert et inclusif.