Clonage, culture cellulaire et expression des protéines
Des constructions de TRPM8 fusionnées en N-terminal avec la mEGFP ont été obtenues via l’assemblage de Gibson afin de sous-cloner les gènes TRPM8 dans un vecteur pFastBac1. La mutagenèse a été réalisée par PCR avec des amorces mutagènes ou par assemblage de Gibson, utilisant la polymérase Q5 à haute fidélité. Les séquences des constructions ont été vérifiées par séquençage Sanger et séquençage de plasmides complets.
Les cellules Expi293F ont été cultivées à 37 °C avec 8 % de CO₂ jusqu’à atteindre une densité de 3 à 3,5 millions de cellules par ml. Pour provoquer une surexpression protéique, un baculovirus (produit selon des protocoles établis) pour TRPM8 hautement fusionné a été ajouté par gouttes pour atteindre une concentration finale de 5 à 10 %. Les cultures virales transduites ont été incubées à 37 °C avec 8 % de CO₂ pendant 16 heures. Pour améliorer l’expression, les cultures ont été enrichies avec 10 mM de sodium butyrate et incubées à 30 °C avec 5 % de CO₂ pendant 72 heures. Les cellules ont été ensuite collectées par centrifugation, lavées avec du DPBS, puis congelées à l’azote liquide et conservées à -80 °C jusqu’à utilisation.
Purification des échantillons pour HDX–MS et cryo-EM
Toutes les étapes de purification ont été effectuées à 4 °C ou sur glace. Le canal TRPM8 a été purifié selon un protocole général identique. Un pellet cellulaire issu d’une culture de 0,5 l de cellules Expi293F (environ 7 à 10 g) a été resuspendu dans un tampon de lyse. La solution a été ajustée et mélangée doucement à 0,5 % de LMNG et 0,5 % de GDN pendant une heure, puis centrifugée. Le surnageant a été appliqué sur de la résine anti-GFP pendant 2 heures. Après lavage, TRPM8 a été digéré avec de la protéase, puis concentré et purifié.
Purification des vésicules cellulaires pour cryo-EM
Un pellet cellulaire à partir d’une culture de 1 l a été resuspendu dans un tampon de lyse, puis homogeneisé et centrifugé. Après filtration et traitement avec de la résine d’échange d’ions, les vésicules ont été liées à la résine anti-GFP, puis traitées pour obtenir l’élution des vésicules concentrées.
Préparation des grilles pour cryo-EM et collecte de données
Les grilles pour cryo-EM ont été préparées selon différentes méthodes de dépendance au menthol, dont certaines grilles ont été gleamées et plongées dans de l’éthane liquide. Les données collectées ont été acquises à l’aide de cryo-TEMs avec des différences dans les réglages de mise au point et de collecte en fonction des types de samples.
Traitement et raffinement des données cryo-EM
Des micrographies corrigées pour les mouvements ont été obtenues puis traitées pour générer un volume de référence permettant de raffiner les modèles 3D. Une série de classifications 3D a permis de dissocier les classes de membranes, révélant des variations de courbure.
Construction de modèles et calculs de paramètres thermodynamiques
Les modèles atomiques de TRPM8 ont été réalisés et affinés, avec des estimations de la taille des pores et des calculs de pKa. Les mesures d’échange hydrogène-deutérium (HDX) ont été détaillées pour étudier les variations thermodynamiques sous différentes conditions.
Points à retenir
- Clonage et expression : Utilisation de l’assemblage de Gibson pour TRPM8, vérifications par séquençage.
- Purification : Protocoles spécifiques pour HDX–MS et cryo-EM identiques pour les canaux aviaires et humains.
- Techniques de cryo-EM : Approcher différentes méthodes de congélation pour optimiser les échantillons.
- Analyse des données : Traitement des données micrographiques avec des outils modernes pour une représentation fidèle des structures.
- Investigations thermodynamiques : De l’importance d’étudier les propriétés de liaison et d’échange à des fins de recherche.
En tant qu’observateur passionné de la recherche biomédicale, je me sens inspiré par ces méthodes complexes qui révèlent les mystères de la biologie. Chaque détail, qu’il s’agisse d’une technique de purification ou d’un raffinage de données, joue un rôle fondamental dans la compréhension de nos mécanismes biologiques. Il est fascinant de constater comment ces découvertes peuvent transformer notre connaissance et potentiellement conduire à des avancées thérapeutiques. Je pourrais passer des heures à discuter de l’impact de ces recherches sur notre futur santé et bien-être.